Течната хроматография разчита на акуратно подготвена мобилна фаза, за да се избегнат голям брой възможни проблеми. Замърсяване, дължащо се на остаряла или направена от разтворители и добавки с неподходящо качество мобилна фаза; разместване на пиковете или невъзпроизводимо време на задържане, когато се опитвате да повторите даден Монографски метод са само част от възможните проблеми. В тази блог-статия, авторката Геневив Ходсън -технически експерт, ще разгледа основните компоненти и стъпки за успешно приготвяне на мобилната фаза и ще завърши с пример за процедура по приготвяне на буферна мобилна фаза.
Всичко за реагентите
Ако сложите нещо некачествено вътре, ще получите нещо некачествено навън. Когато подготвяте мобилната фаза за ТХ (течна хроматография) е необходимо да започнете с подходящия за вашата система клас разтворители. Ако използвате ВЕТХ (HPLC) то това ще са HPLC клас разтворители като Метанол или Ацетонитрил, ако използвате мас-спектрометър, тогава ще имате нужда от по-висок клас. Водата, която използвате трябва да е бутилирана и в съответния клас, отговарящ на разтворителите или от система за дейонизирана вода с висока чистота (напр. MilliQ ). След отваряне на бутилирана вода, тя трябва да се ползва в рамките на 1 седмица, за да сте сигурни, че не е преседяла толкова дълго за да се развият микроорганизми в нея. Ако използвате система за получаване на дейонизирана вода е нужно да се уверите, че филтрите и мембраните се подменят редовно и в хроматографския апарат не влиза вода с ниско качество.
Всеки един използван химикал трябва да e с подходящо качество и да се ползва в рамките на срока на годност, тъй като продуктите от разпада на остарял реактив могат да се покажат като неизвестни пикове в „празната“ хроматограма (blank chromatogram). Някои добавки могат да се развалят и по-бързо от оказаната дата на годност на опаковката, след като е отворена. Този процес е нужно да се изследва в етапа на отстраняване на непознатите пикове. Високият процент органика може да извлече замърсявания от разтворител от по-нисък клас, които да изглеждат като замърсявания в самата пробата. Пускането на празна проба за матрица ви позволява да установите такива замърсявания и да ги вземете предвид при анализа. Използването на подходящ клас разтворители намалява до минимум замърсяванията и удължава живота на вашата колона.
Всичко за pH
Буферите имат способността да поддържат мобилната фаза при постоянно рН дори когато малко повече киселина или основа се добавят към системата. Хидрофобността е термин, който се използва, за да опише дали едно съединение предпочита повече вода или органика. LogP, или коефициентът на разпределение е мярка за разтворимостта на дадено съединение в два несмесващи се разтворителя, обикновено октанол и вода. LogP на съединенията се влияе от рН или с други думи, колко хидрофобно се държи дадено съединение зависи от нивата на рН за дадения метод. По-високо или по-ниско рН може да промени задържането на дадено съединение. Ако мобилната фаза е подготвена при различно рН от посоченото в метода, времето на задържане на чувствителни към pH съединения също може да се промени.
Стойността на рН на мобилната фаза може да повлияе и на формите на едно съединение. За съединения, които се йонизират това се проявява като един идеален пик или разцепен пик, където са налични и двете форми едновременно.
Бележка на автора: полезен инструмент, който използвах за химически калкулации, търсене и обръщане на име към структура е www.chemicalize.com
Двете обичайни добавки за мобилна фаза, ползвани при ТХ буферни разтвори са фосфат и ацетат. Фосфорната киселина има три стойности на pKa – 2.15, 7.20 и 12.33. Буферния капацитет е ± 1 pH единици от pKa на добавката, което означава, че трите буферни диапазона за фосфата са 1.15-3.15, 6.20-8.20 и 11.33-13.33. Ако киселинността се промени на рН 5, например, фосфатния буферен разтвор ще изгуби буферния си капацитет и няма да може да поддържа рН за йонизиращото се съединение.
Когато подготвяте буферна или мобилна фаза с определено рН, смесете добавките първо с вода и след това настройте рН като използвате противойон. Пример за подходящи противойони, които можете да ползвате за натриев фосфат са фосфорна киселина – за да намалите рН или натриев хидроксид – за да го увеличите. Важно е да не добавяте органика преди да сте настроили рН-то, защото това ще промени отчитането на рН и мобилната фаза няма да е правилно подготвена. Органиката следва да се добави след постигане на желаното рН при водния разтвор.
Всичко за филтрирането
След като мобилната фаза е добре смесена, пристъпваме към последната стъпка на подготовката й – филтрирането с вакуумна система. Филтрите за мобилна фаза са с най-разнообразни мембрани и следва да ги подберете според разтворителите, които ще филтрирате. Мембраните от регенерирана целулоза (Regenerated Cellulose (RC) често се прилагат при методи с обратна фаза тъй като хидрофилната им природа е подходяща за водни разтворители. За ВЕХТ (HPLC) системи са подходящи мембрани с размер на порите поне 0.45 μm, а за УВЕХТ (UHPLC) – 0.20 μm. Тази стъпка премахва последните останали при подготовката на мобилната фаза частици и предпазва системата и колоната от запушване.
Източник: Science Unfiltered – Mobile Phase Preparation – Steps to Take for Ideal Analysis
